分離度方程式可以確定影響分離度的參數：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。
在過去幾年里，柱效和使用超高效色譜柱（被稱為“UHPLC”色譜柱）作為實現分離目標的手段已得到了極大的重視。
UHPLC已通過更快速的分離和更快速的方法開發提高實驗室生產力來證明了其價值。
然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強調柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。
在影響分離度的三個參數中，選擇性是最為重要的。
（參見圖1）通過利用柱效和選擇性，通常可以實現更好和更快的分離。
圖 1：N、α和k對分離度（Rs）的影響
提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。
然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對分離度的改善效果也逐漸降低。
另一方面，提高選擇性（α）則沒有這個問題，因此其成為開發分離方法時的最佳優化變量。
在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機制，這可以用來實現分離。
這些相互作用機制包括：疏水性結合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。
不同類型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機制，這取決于分析物和流動相條件。
表1: 比較不同鍵合相的分離機制/相互作用
|
ACE 鍵合相 |
疏水性結合 |
π–π |
氫鍵結合 |
偶極-偶極 |
形狀選擇性 |
|
C18 |
強 |
無 |
無 |
無 |
弱 |
|
C18-HL |
極強 |
無 |
無 |
無 |
弱 |
|
C18-AR |
強 |
強 |
中等 |
中等 |
中等 |
|
C18-PFP |
強 |
強 |
強 |
強 |
強 |
|
AQ |
中等 |
無 |
中等 |
弱 |
無 |
|
C8 |
中等 |
無 |
無 |
無 |
無 |
|
C4 |
弱 |
無 |
無 |
無 |
無 |
|
苯基 |
中等 |
強 |
弱 |
中等 |
弱 |
|
CN |
弱 |
無 |
弱 |
強 |
無 |
利用鍵合相的選擇性實現更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機制（特別是疏水性結合）的強度方面，它們存在顯著差異。
C18-AR可能具有其它不同的分離機制，可以為復雜的混合物帶來更好的分離效果。對于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優勢。
當開發分離方法時，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機制。
非常強大且獨特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過利用柱效和選擇性，可以實現更好的分離。
圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較
色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動相：
A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內從3至100%B，并持續1分鐘。
樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡因
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林
C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。
圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實例。
一個分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。
C18-PFP鍵合相提供的額外分離機制，使得總體分離效果更佳出色。
圖 3：ACE Excel可以獲得卓越的分離度和峰形：藥物及其相關物質的UHPLC結果
條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動相：
A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內從3至100%B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測：UV 254 nm
樣品
1. 對乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜
在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產生色譜圖。
然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優越的總體分離性能。
